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真空冷凍干燥技術在細胞生物學領域的應用

 發布時間:2023-09-15 點擊量:362

生物學研究與臨床經常需要使用到紅細胞,然而血液紅細胞的采集過程比較繁瑣,并且有些珍貴血液采集機會難得,所以就需要有效的保存液來維持所采集的紅細胞的活性。然而,目前大部分血液是在4℃的冰箱保存,保存時間僅為20天左右,難以滿足長時間保存的需要;此外,紅細胞的保存液多采用常溫下的短期保存和深低溫下的長期保存,因此保存和運輸存在很大困難。并且隨著保存時間的延長,紅細胞易被氧化損傷,紅細胞膜結構和功能會發生改變,進而影響其穩定性及功能性。

 

 

01 應用背景

 

 

 

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近年來,對于蛋白及紅細胞的保存大多是采用冷凍干燥技術,即通過低溫與真空條件的控制,一方面能使蛋白及紅細胞中的熱敏成分與易氧化成分不被破壞損傷,另一方面還能阻止微生物生長以及水為介質的生化反應等,從而使蛋白及紅細胞保持其原有的生物活性。通過冷凍干燥后的紅細胞能夠實現常溫下的長時間保存,并且其性能穩定、輸注方便、便于運輸,在新醫療領域具有重大的應用價值。

然而,紅細胞在凍干及復水的過程中極易受到外界的影響,導致紅細胞凍干后復水的存活率不是很高;而且目前研發的細胞凍干保護劑存在成分復雜、凍存工藝參數不易控制等缺陷,使得紅細胞存活率低、凍存紅細胞易發生形態變異、凍干紅細胞酶活性低等。因此,尋找一種安全性高,凍干紅細胞存活率高、活性高的紅細胞凍干與復水工藝,是推廣紅細胞臨床使用的關鍵。

 

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02 影響干燥速率的因素

 

 

 

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近年來,研究發現有機溶劑的存在可以影響溶液的凍結特性,進而可能影響干燥速率和凍干品的外觀。叔丁醇作為有機溶劑的一種,深受眾多研究者關注,但是它對紅細胞冷凍干燥過程的影響如何,對紅細胞回收率是否有影響也從未見報導過。專家指出,滲透性保護劑與非滲透性保護劑的聯合使用能達到較好的冷凍前脫水目的。采用40%滲透性保護劑甘油對紅細胞進行預處理,再加入非滲透性凍干保護劑進行凍干的方法來研究滲透性保護劑預處理對紅細胞凍干效果的影響。采用無損的微CT掃描技術,對正在升華過程的紅細胞樣品進行掃描觀察,以期探索叔丁醇對干燥過程的影響。通過對凍干紅細胞樣品進行CT掃描,計算得到孔隙率,判斷甘油對紅細胞體積的影響,認識叔丁醇濃度對冰晶大小的影響。利用血球計數板進行凍干前后細胞計數,得到甘油和叔丁醇的共同作用情況。

在紅細胞冷凍干燥過程中,利用微CT掃描技術進行樣品升華干燥過程的定時掃描觀察,并對凍干品進行內部結構掃描分析,同時計算得到各個樣品的孔隙率值。對凍干后的樣品,采用三步法復水,用血細胞計數板進行檢測。實驗結果表明,有機溶劑叔丁醇可以加速凍干過程,縮短干燥時間,并且濃度為10%的比5%的顯著。在升華過程中,孔隙率呈下降的趨勢。最高的孔隙率出現在含有10%叔丁醇的經甘油預處理的保護劑配方中。經過甘油預處理,細胞的恢復率得到了明顯的提高,而叔丁醇的加入,導致一定程度上的恢復率下降。

 

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03 凍干設備推薦

 

 

 

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富睿捷原位凍干機Mercury系列0.1㎡、0.3㎡機型,不僅可以做凍干處理,還能真正實現整個凍干過程可控,使得樣品效率更高,能耗更低,凍干的品質更佳,樣品結果均一性高,凍干工藝的重復性好。另外,還可以實現凍干工藝的摸索,優化,放大工藝,共晶點測試等。制冷系統采用自主研發混合制冷技術,可實現溫度更低,穩定性更好。不銹鋼冷阱的冷凝溫度達-80°C左右,凍干倉真空度可達 0.2Pa。紅細胞樣品凍結至-50°C左右,保持1h后開始抽真空,一次干燥擱板溫度為-30°C,持續30h;二次干燥溫度為10°C,持續10h,真空度低于10Pa。

原位凍干機優勢:

  • 內置直立式不銹鋼冷阱盤管,能夠捕獲樣品凍干過程中升華的水汽,使得凍干倉里的水汽更少,避免水汽在凍干倉內形成內循環,讓倉體內的水汽液化成液滴附著在樣品,整個過程是放熱反應,如若處理不當會造成有些樣品融化、變質或坍塌等;

  • 標配高精度皮拉尼真空計,保證真空度的準確性,能夠更好的完成凍干實驗,最終實現品質、效率,能耗的平衡;

  • 標配凍干終點判定系統,系統可以提醒用戶樣品是否凍干完成,十分便利,避免采樣檢測,外掛檢測等,讓整個實驗過程省時,省心,省力。

  • 預凍溫度可達-80℃,可充分保證樣品凍結狀態,做好樣品的預凍處理,也保證了諸如一些低共晶點樣品不會因為溫度不夠而融化或預凍不結實等問題。

  • 隔板溫度范圍-55到55℃;更大的溫度調控范圍,為凍干曲線摸索和優化,工藝放大提供便利條件,提供更大范圍的凍干過程的隔板溫度調控,實現凍干效率的提升,包括探尋最佳的凍干曲線等。

  • 隔板的溫差為±1℃,能夠保證均一性,合格率更高。

微CT技術可以無損的對物料內部進行檢測,通過把微CT掃描技術引入到紅細胞冷凍干燥中,進行干燥過程的定時掃描觀察,并對凍干品進行內部結構重構分析,得到結論為有機溶劑叔丁醇可以加速凍干過程,縮短干燥時間,10%濃度的叔丁醇效果比5%的顯著很多;在升華過程中,孔隙率呈下降的趨勢,因為由叔丁醇形成的針狀冰晶和甘油預處理所導致的細胞體積增大,最高的孔隙率出現在含有10%叔丁醇的經甘油預處理的保護劑配方中,經過甘油預處理,細胞的恢復率得到了顯著的提高,而加入叔丁醇,細胞的恢復率又顯著下降。由于叔丁醇升華過程留下了管狀通道含10%叔丁醇的保護劑配方可以更好的保持細胞的完整性。

 

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04 總結

 

總之,把叔丁醇引入到紅細胞的冷凍干燥中是否恰當,以減少細胞恢復率為代價的縮短凍干時間是否值得,還有待深入研究。此外,在藥品的冷凍干燥過程中,如果干燥時間過長,則藥性或者其作用成分將會受到影響,故而加快干燥過程的進行很有必要,如果能把叔丁醇引入到藥品的凍干生產上,將會產生十分可觀的效益。


富睿捷致力于服務各個有冷凍干燥需求的領域,專業售前人員根據您的樣品需求提供一站式的凍干解決方案,讓您全身心投入到實驗研究中,免除后顧之憂。同時,富睿捷也可提供免費做樣服務,如有凍干需求,可聯系我們。

                         

 

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